觀察GFP熒光蛋白有哪些方法？

 觀察GFP熒光蛋白有哪些方法？

 綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一類存在于腔腸動物體內的生物發光蛋白。GFP具有多種優點：易于檢測，靈敏度高；熒光性質穩定，耐受性強；易于表達，無細胞毒性；可用于活細胞檢測。因此，GFP可作為報告基因用于檢測基因表達或調控，或作為融合標簽來檢測蛋白質分子的定位、遷移、構象變化以及分子間的相互作用，或者靶向標記某些細胞器。GFP吸收的光譜最大峰值為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；發射光譜最大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發光對細胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩定，在激發光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長下更穩定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。

觀察GFP熒光蛋白方法有：

1.便攜式GFP激發光源：

采用便攜式GFP激發光源(又叫熒光蛋白觀測鏡）是最便捷、最方便的觀察方法，因GFP在470nm有一個很高的吸收峰，采用 470nm激發光源能夠激發GFP發出明亮的綠色熒光，在觀察gfp熒光時，因為激發光為強烈的藍色光線，必須佩戴專業的觀察眼鏡才能觀察到清晰的熒光信號。推薦使用美國路陽LUYOR-3260便攜式激發光源。

上圖為采用便攜式GFP激發光源觀察到的效果

2. 紫外光源：

采用紫外光源（又叫紫外線燈、黑光燈）觀察也非常方便，但如果觀察植物，植物葉片的葉綠色在紫外線燈下也會發出熒光，對gfp發出的熒光也會產生干擾，另外，標本長時間在紫外光源照射下對GFP標本組織也會造成破壞。

上圖為紫外線燈照射含有GFP葉片的效果。

3.熒光顯微鏡

 熒光顯微鏡(Fluorescence microscope) ： 熒光顯微鏡是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體，使之發出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。 細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。目前在常用的方法就是采用熒光顯微鏡觀察，熒光顯微鏡在實驗室非常普及，但唯一的不足是必須采集葉片或動物切片進行觀察，對培養的標本進行破壞，無法進行活體觀察。

上圖為熒光顯微鏡觀察GFP的效果。

綜合分析，采用采用便攜式GFP激發光源（又叫轉基因生物觀測鏡）是觀察熒光蛋白GFP最便捷、最方便的方法.